Trận chiến ở Toro, trận chiến giúp Isabella có được thế thắng ngai vàng Castilla.

Năm 1474, ngày 12 tháng 12, Vua Henry IV qua đời ở Madrid, tin tức nhanh chóng chuyển đến triều đình Segovia. Isabella nhanh chóng dời đến Lâu đài Segovia, nơi bà nhận được toàn bộ sự ủng hộ của Andres de Cabrera và các triều thần thề tận trung với bà. Ngày hôm sau, 13 tháng 12, Isabella tuyên bớ trở thành Nữ vương của Castilla và León.

Sự lên ngôi của Isabella về cơ bản là đầy chông gai, đây là bởi vì con gái của Vua Henry IV, công chúa Joanna la Beltraneja, đã trưởng thành vào thời điểm ấy, cũng như không ít người nhận thấy Isabella không thích hợp trở thành Nữ vương. Diego Lopez de Pacheco, Hầu tước Villena, đã cùng các phe phái thề tận trung với công chúa Joanna. Sau tuyên bố của Hầu tước Villena, Tổng giám mục Toledo là Alfonso Carrillo de Acuña, một người từng tận trung với Isabella đã quay ra ủng hộ công chúa Joanna và rời khỏi Segovia để về phe Hầu tước Villena. Cả hai người bày mưu công chúa Joanna sẽ kết hôn với người cậu, Vua Alfonso V của Bồ Đào Nha, và sau đó cả hai sẽ đưa quân đội Bồ Đào Nha đến xâm lược Castilla để giành lại ngôi báu. Vào tháng 5 năm 1475, Vua Alfonso đem quân vượt qua biên giới Castilla và tiến đến Plasencia, nơi mà ông ta cưới công chúa Joanna, người cháu gái chỉ mới 13 tuổi. Đó là sự khởi đầu của cuộc chiến kế vị Castilla, mà lịch sử gọi là [War of the Castilian Succession].

Ngày 1 tháng 3 năm 1476, diễn ra Trận Toro, một cuộc chiến còn gây tranh cãi vì cả hai bên đều tuyên bố mình là người thắng, song lại có ý nghĩa lịch sử trọng đại đối với Isabella và Ferdinand[7][8][9][10][11][12]. Sau đó, quân đội của Joanna la Beltraneja bị giải thể, và quân Bồ Đào Nha rút lui khỏi Castilla. Nhà sử học Justo L. González tóm tắt:

Cả hai bên lập phòng tuyến đối doanh trại diện nhau ở Toro, kết quả của việc do dự tiến công. Và trong khi Quốc vương Bồ Đào Nha đang cải tổ lại quân đội, Ferdinand liền gửi tin đến khắp các thành phố ở Castilla cũng như các quốc gia lân bang, loan tin rằng quân đội của Castilla đã thắng lớn và giáng một cú vỡ mật cho quân đội Bồ Đào Nha. Đối diện với tin tức này, tập đoàn của "la Beltraneja" [Joanna] lập tức giải tán, và quân đội Bồ Đào Nha rút khỏi quốc gia này[13].

Chớp ngay thời cơ còn mơ hồ khi ấy, vào khoảng tháng 10 năm 1476, Isabella lập tức triệu tập đồng minh tại Segovia, tuyên bố đứa con gái đầu tiên của bà là Isabella sẽ trở thành Trữ quân của ngai vàng Castilla. Tuyên bố này đã khiến Isabella trở thành quân chủ có người thừa kế, cũng khiến quyền vị của bà được hợp pháp hóa.

Cũng trong khi ấy, vào tháng 8, ở Segovia xảy ra bạo loạn, và Isabella đã thể hiện mình là một quân chủ đầy quyền uy ngay lúc cần thiết nhất. Phiến loạn tràn vào Segovia đầy hỗn loạn, Isabella một mình cưỡi ngựa lãnh đạo quân đội bình định, vì chồng bà là Ferdinand lúc này đang ở ngoài chiến đấu với quân Bồ Đào Nha. Mặc cho các cố vấn nam giới khuyên can, Isabella vẫn tự tin cưỡi ngựa vào tòa thành này, đối diện với thủ lĩnh quân phiến loạn và tiến hành thỏa hiệp, kết quả ngoài sức tưởng tượng khi quân phiến loạn nhanh chóng phục tùng và giải tán[14]. Hai năm sau, Isabella hạ sinh người con trai mà bà yêu thương nhất, John, Thân vương xứ Asturias, vào ngày 30 tháng 6 năm 1478. Sự ra đời của người con trai này càng làm Isabella ở vững trên ngai vị Nữ vương.

Bản đồ Bồ Đào Nha sở hữu các thuộc địa ở phía Tây của Châu Phi, vẽ ở thế kỉ thứ 16.

Trong lúc này, hạm đội hải quân Castilla và Bồ Đào Nha đang giành quyền bá chủ ở Đại Tây Dương, kéo theo việc tranh giành thành phố Guinea, nơi có nhiều vàng và nô lệ rất cần thiết khi ấy cho nền quân chủ Châu Âu. Điều này đã dẫn đến trận chiến quyết định là Trận Guinea[15][16]. Cuộc chiến kéo dài 3 năm, với việc Castilla làm chủ đất liền còn Bồ Đào Nha làm chủ đại dương[17]. Ngày 4 tháng 9 năm 1479, Hòa ước Alcáçovas được ký kết, với việc Bồ Đào Nha từ bỏ ngai vị Castilla, đổi lại Isabella chia sẻ một phần lãnh địa quanh Đại Tây Dương cho phép Bồ Đào Nha cùng khai thác (trừ khu vực Quần đảo Canaria, thì mỏ vàng của Guinea, các đảo Cabo Verde, Madeira, Azores và quyền xâm chiếm Vương quốc Fez đều thuộc về Bồ Đào Nha[18][19]), cùng đền bù chiến phí khổng lồ: 106.676 đồng vàng. Isabella cũng phải chấp nhận Joanna la Beltraneja được ở lại Bồ Đào Nha, cũng như đại xá cho bất kỳ thế lực nào từng ủng hộ Joanna và Bồ Đào Nha xâm chiếm Castilla.

Với cái kết này, Isabella và Ferdinand có được ngai vàng, song đã phải từ bỏ nguồn lợi nhuận khổng lồ ở Đại Tây Dương. Nhà sử học hàn lâm Tây Ban Nha là Antonio Rumeu de Armas nhận xét bản hòa ước Alcáçovas này, hai vụ Quân chủ Công giáo đã phải "... mua hòa bình với cái giá quá chát". Về sau, chuyến du hành của Christopher Columbus đã giải tỏa áp lực này của Castilla.